Методы исследований

ПЦР ПЦР в реальном времени Мультиплексная ПЦР Секвенирование по Сэнгеру NGS (секвенирование нового поколения) ВЭЖХ-МС/МС G-бэндинг FISH

ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Метод был разработан Кэри Мюллисом в 1983 году, за которую он получил Нобелевскую премию. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определённых участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.

К преимуществам метода относятся:

высокая специфичность – способность определять заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену;
чувствительность – для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена, чтобы он был обнаружен в ходе исследования;
скорость проведения – лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, пациент — уже на следующий день;
универсальность – для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и др.

Метод активно применяется в медицине для диагностики инфекций, генетических заболеваний, онкологии. В криминалистике для идентификации личности, в экологии и других областях.

ПЦР в реальном времени (RT-PCR)

ПЦР в реальном времени — количественный анализ, отслеживающий процесс амплификации. Метод, основанный на полимеразной цепной реакции позволяет определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий.

Ключевое отличие ПЦР в реальном времени от обычной методики — возможность отслеживать ход процесса амплификации в реальном времени: количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток: зондов или интеркаляторов. Эти метки вызывают изменение флуоресцентного сигнала, измеренного прибором, после их прямого взаимодействия с ампликоном или гибридизации с ним.

Открытие метода ПЦР радикально изменило биологические и медицинские науки. Преимущества ПЦР в сравнении с другими методами — это простота, доступность и относительная дешевизна компонентов, сочетающиеся с высокой чувствительностью и специфичностью метода. При этом в современном варианте ПЦР протекает достаточно быстро — получить миллиарды фрагментов ДНК из всего одной копии можно за 45-60 минут.

Мультиплексная ПЦР (Multiplex PCR)

Мультиплексная ПЦР (Multiplex PCR) — это вариант полимеразной цепной реакции, при котором одновременно амплифицируют несколько различных последовательностей ДНК с использованием нескольких наборов праймеров в одной смеси, что дает возможность получения максимума информации из одного образца за одну постановку ПЦР с минимальными затратами на расходные материалы.

Метод применяется для идентификации патогенов, высокопроизводительного генотипирования SNP, анализа мутаций, анализа делеции гена, судебно-медицинских исследований.

Секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование по Сэнгеру (метод обрыва цепи) — классический метод определения нуклеотидной последовательности ДНК, разработанный Фредериком Сэнгером в 1977 году. Он стал основой для расшифровки генома человека в рамках проекта «Геном человека» и до сих пор остаётся «золотым стандартом» для валидации результатов других методов.

Суть метода: одна из цепей изучаемой ДНК выступает в качестве матрицы (шаблона). Во время исследования с помощью фермента ДНК-полимеразы для неё синтезируется подходящая вторая цепь нуклеотидов. При этом реакция синтеза второй цепи ДНК происходит таким образом, что на определённом отрезке она перестаёт синтезироваться — «обрывается». По тому «обломку» второй цепи, который получается в результате реакции, можно установить последнюю «букву» секвенируемого фрагмента ДНК. Метод позволяет прочитывать последовательности длиной до 1 000 пар нуклеотидов и обычно применяется для анализа небольших участков генома, например одного экзона (участка) гена или фрагмента экзона гена.

Несмотря на появление NGS, метод Сэнгера сохраняет актуальность благодаря высокой точности и простоте. Он остаётся ключевым инструментом для анализа коротких участков ДНК и подтверждения критических генетических данных.

Секвенирование «нового поколения» (Next Generation Sequencing, NGS)

Секвенирование нового поколения (NGS) — это технология массового параллельного анализа ДНК и РНК, позволяющая быстро и точно определять нуклеотидные последовательности. Она произвела революцию в области Life Science, позволяя быстро и точно расшифровывать последовательности ДНК и РНК и открывая новые горизонты для научных исследований и медицинской диагностики стала ключевым инструментом в генетических исследованиях, клинической диагностике и персонализированной медицине.

В отличие от классического метода Сэнгера, который секвенирует один фрагмент ДНК за раз, NGS работает с большим количеством фрагментов одновременно, что значительно увеличивает скорость. Метод используется для диагностики наследственных заболеваний и онкологии, пренатальной диагностики, исследованиях в области фармакогенетики.

NGS-технология включает несколько этапов: подготовку библиотеки ДНК, амплификацию фрагментов, их секвенирование и биоинформатический анализ полученных данных. Суть метода заключается в разделении молекулы ДНК конкретного человека на отдельные гены с последующим рассмотрением и фиксацией найденных отклонений от нормального строения каждого гена из интересующего списка (панели генов). Обработка огромного количества информации о ДНК конкретного человека, получаемого при NGS, позволяет определить и описать (указать расположения в конкретном гене) отклонения от нормального для популяции строения ДНК, сравнить имеющиеся сочетания различных мутаций с базами данных для определения фактора онкогенности (способности вызывать онкологическое заболевание) выявленных «наборов» мутаций, а так же выявить мутации, ассоциированные с наследственными (семейными) раками, и указать в заключении на необходимость дополнительной консультации с онкологом для принятия мер по предупреждению и раннему выявлению начала заболевания.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС)

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) — это гибридный аналитический метод, сочетающий разделение сложных смесей в ВЭЖХ с высокочувствительным и селективным детектированием в масс-спектрометре. Он широко применяется в фармацевтике, медицине, экологии и других областях для идентификации и количественного определения веществ.

Метод сочетает высокую разделительную способность жидкостной хроматографии для сложных образцов с высокой селективностью, чувствительностью и способностью масс-спектрометрии предоставлять информацию об относительной молекулярной массе и структуре. Принцип его работы следующий: проба отделяется от подвижной фазы в масс-спектрометрической части, ионизируется, затем масс-анализатор разделяет фрагменты ионов по массовым числам, а масс-спектры получают детектором.

ВЭЖХ-МС/МС широко применяется в медицине для ранней диагностики и мониторинга заболеваний.

С помощью метода измеряют концентрации лекарственных средств в биологических средах организма (цельная кровь, плазма крови, моча и др.), осуществляя терапевтический лекарственный мониторинг, что позволяет подобрать дозировку и режим приёма препарата, которые обеспечат его оптимальную концентрацию в организме; проводят анализ различных гормонов (эндокринология) и функциональную диагностику для выявления причины плохого самочувствия пациента, когда симптомы не дают чёткой клинической картины; появляется возможность выявить более 500 наркотических соединений и их метаболитов за один анализ (Клиническая токсикология).

G-бэндинг (G-banding)

G-бэндинг — это метод, который позволяет получить видимый кариотип, окрашивая конденсированные хромосомы. Он был разработан в 1970-х годах и стал значительным прорывом в цитогенетике.

При G-бэндинге метафазные хромосомы обрабатывают трипсином для частичного расщепления и окрашивают красителем Гимзы. Гетерохроматические области, которые богаты аденином и тимином, окрашиваются более тёмным цветом. Менее конденсированный хроматин, который богат гуанином и цитозином, проявляется в виде светлых полос. Рисунок полос пронумерован на каждом плече хромосомы от центромеры до теломеры. Эта система нумерации позволяет точно идентифицировать и описать любую полосу на хромосоме.

Метод имеет широкий спектр применения в цитогенетике, включая генетическую диагностику и исследования эволюции, вариации и структуры хромосом.

FISH (флуоресцентная гибридизация in situ)

Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Суть исследования заключается в использовании ДНК-зондов со специальными метками. Они связываются с определёнными участками хромосом и заставляют их светиться при изучении под флуоресцентным микроскопом. В процессе проведения FISH-теста в биоматериал, полученный от пациента, вводят флуоресцентные метки, которые способны связываться исключительно с чётко определёнными участками хромосомного набора клетки. Затем окрашенный тканевой образец помещают под флуоресцентный микроскоп и если исследователь обнаруживает участки хромосом с присоединёнными к ним светящимися метками, то это является показателем отклонений, которые свидетельствуют о наличии изменений генома.

FISH позволяет оценить генетический статус отдельной клетки и выявить, к примеру, несколько аномальных клеток среди тысяч других с нормальным генотипом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода. Метод используют в различных медицинских и исследовательских целях, включая диагностику генетических заболеваний, обнаружение раковых клеток, картирование генов, выявление инфекционных заболеваний и изучение экспрессии генов. Анализ выполняется быстро – от 3 до 7 дней и обладает высокой точностью: чувствительность и специфичность составляют более 90%.